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四正柏凋亡檢測試劑盒說明書

更新時間:2024-04-08點擊次數:1934

四正柏凋亡檢測試劑盒說明書

相關介紹:細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面,這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外,使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂,正常主要存在于細胞膜的內面,在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V具有易于結合到磷脂類如PS的特性,對PS有高度的親和性。因此,該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨te的,也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的,而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此,可以采用Annexin V與PI雙染的方法,通過流式檢測細胞早期凋亡。

儲存條件:2-8℃避光保存,勿冰凍。

有 效 期:一年

注意事項:本試劑盒需使用流式細胞儀進行檢測。此產品僅供研究,不用于臨床診斷。

操作步驟:

  1. 細胞樣品的準備:

    a)對于貼壁細胞:小心收集細胞培養液到一離心管內備用。用不含EDTA的胰酶消化細胞,至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時,加入前面收集的細胞培養液,吹打下所有的貼壁細胞,并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內。1000rpm左右離心5min,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞無法完quan離心至離心管底,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50µl左右的培養液,以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清。

    b)對于懸浮細胞:1000rpm左右離心5min,沉淀細胞。對于特定的細胞,如果細胞無法完quan離心至離心管底,可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約50µl左右的培養液,以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS,重懸細胞,再次離心沉淀細胞,小心吸除上清。

  2. 用去離子水按1:3稀釋結合緩沖液(4ml 4x結合緩沖液+12ml去離子水);

  3. 用1x結合緩沖液重新懸浮細胞,調節其濃度為1-5×106/ml;

  4. 取100µl的細胞懸液于5ml流式管中,加入5µl Annexin V/FITC混勻后于室溫避光孵育5分鐘;

  5. 加入10µl 20ug/ml的碘化丙錠溶液(PI),并加400µl PBS,立刻進行流式檢測。

實驗設計:

空白管:陰性對照組細胞,不加Annexin V/FITC,碘化丙錠溶液(PI)。用于調節電壓單染管:陽性對照組細胞,只加Annexin V/FITC。用于調節補償

檢測管:處理的細胞,加 Annexin V/FITC,碘化丙錠溶液(PI)。用空白管和單染管調節好電壓補償后,獲得所需要的流式數據。

樣本分析:

1. 流式細胞儀分析:FITC 的最大激發波長是 488nm,最大發射波長是 525nm,建議選擇FL1 通道檢測;PI-DNA復合物的最大激發波長是 535nm,最大發射波長為 615nm,PI 的紅色熒光在 FL2 或 FL3 通道檢測。用FlowJo等軟件進行分析,繪制雙色散點圖(two-color dot plot),FITC 為橫坐標,PI 為縱坐標。典型的實驗中,細胞可以分成三個亞群,活細胞僅有很低強度的背景熒光,早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光,晚期凋亡或壞死的細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

2. 熒光顯微鏡觀察:

a)滴一滴用 Annexin V-FITC/PI 雙染的細胞懸液于載玻片上,并用蓋玻片蓋上細胞。

b)在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色,PI 熒光信號呈紅色。

【注】:對于貼壁細胞,可直接用蓋玻片培養細胞并誘導細胞凋亡。

相關產品:

貨號

產品名稱

應用

FXP022

AnnexinV Alexa-Fluor488/PI 凋亡檢測試劑盒

FC

FXP023

AnnexinV Alexa-Fluor647/PI 凋亡檢測試劑盒

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FXP025

AnnexinV-eGFP/PI凋亡檢測試劑盒

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Annexin V-PE/7-AAD 凋亡檢測試劑盒

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